METODO

AISLAMIENTO de POLIMORFONUCLEARES de SANGRE PERIFERICA
Ultima revisión: 30 abril 1997

APLICACION:

Análisis de función de los neutrófilos
Espectroscopía de citocromo b588
Citometría de flujo para H2O2
Western blot para las proteinas de la NADPH oxidasa

INVESTIGADOR o INSTITUCION QUE APORTA el METODO

Dra. Diana Garcia de Olarte
Programa de Vigilancia Epidemiológica para el Síndrome de Infección Recurrente Patológica e Inmunodeficiencias Primarias
Laboratorio de Inmunología (206)
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia
Carrera 52D N° 62-28.
Medellin - Colombia

Teléfonos: (57 4) 510 60 60, 510 60 61

Fax: 263 35 09 o 2638282.

Consultas a:
Dra Diana Garcia de Olarte

REACTIVOS

Poner 800 ml de agua MQ en un beaker, agregar el NaCI/agitación, adicionar el dextrán lentamente, a pequeños chorros.

Cantidad a 1.000 ml agua MQ, almacenar a 4°C.

PROCEDIMIENTO

1. Colectar sangre periférica en tubos de propileno o jeringas que contengan 1/5 del volúmen en ACD. El volúmen de sangre depende de las pruebas a realizar: en general es > 40ml. La proporción de ACD/sangre nunca debe variarse. Agitar o invertir suavemente la mezcla. Como el ACD es hipertónico debe asegurarse que se mezcle rápidamente con la sangre.

2. Adicionar dextrán al 6% con Na Cl 0.8% usando la mitad del volúmen de la mezcla sangre/ACD (36 ml de dextran /72 ml de la mezcla sangre/ACD), mezclar suavemente y depositar en tubo graduado de polipropileno de 100 mi/Dejar sedimentar/1 hora.

3. Depositar el sobrenadante en tubos de polipropileno de 50 ml.

4. Descartar los glóbulos rojos. Centrifugar ios tubos/240 xg / 12 min/4°C/freno suave.

5. Descartar el sobrenadante y resuspender el boton en 25 ml de PBS frio usando una pipeta para transferir. Reunir los botones si hay varios, a no ser que se extraigan mas de 240 ml de sangre, en cuyo caso se depositan en dos o mas tubos.

6. Centrifugar el tubo/300 xg /6 min / 4°C / freno fuerte.

7. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón en 6 ml de agua MQ fria mezclando continuamente con una pipeta pasteur/30seg, no excederse, transcurridos los 30 segundos adicionar 3 ml de KCI 0,6 M frio y mezclar.

8. Llevar a 20 ml/PBS frio.

9. Centrifugar el tubo / 300 xg /6 min / 4°C/freno fuerte.

10. Realizar esta lisis 3 veces.

11. Descartar el sobrenadante y resuspender el boton en 2,5 ml de PBS frio, mezclar con pipeta pasteur y depositar suavemente en un tubo de polipropileno de 15 ml que contiene 4 ml de Ficoll - Hypaque.

12. Centrifugar/400xg / 30 min / 4°C/freno suave.

13. Sacar la capa de linfocitos / monocitos con pipeta pasteur, mantener el tubo en hielo.

14. Eliminar el sobrenadante y resuspender el boton en 20 ml PBS frio, si hay mas de un boton reunirlos en este paso.

15. Centrifugar / 240 xg / 6 min / 4°C / freno fuerte.

16. Lavar nuevamente las celulas en 15 ml de PBS frio.

Centrifugar/240 xg/6min/4°C.

17. Descartar el sobrenadante y resuspender el boton en un volumen conocido de PBS (Usualmente 3-1 Oml).

18. Determinar viabiliadad, pureza y numero de celulas con azul de tripano y violeta de genciana en cámara de Neubauer

VALORES NORMALES e INTERPRETACION de RESULTADOS

Este método sirve de preparacion para efectuar otros analisis de funcion de los neutrófilos. No constituye en test diagnóstico en si mismo.

METODOS ALTERNATIVOS

No existen métodos mejores.

REFERENCIAS

Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 19. Scand J Clinc Invest 21 (Suppl 97): 77 - 89, 1968

Curnutte JT, Scott PJ, Babior BM, Functional defect in neutrophil cytosol from two patients with autosomal recessive cytochrome-positive chronic granulomatous disease. J Clin Invest 83: 1236 - 1240, 1989.