METODO

PROTOCOLO de NBT en PLACA
Ultima revisión: 30 abril 1997

APLICACION

A. Clasificación fenotípica

5.4 Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)

Para detalles, ver: Confirmación del diagnóstico e identificación del defecto molecular de la enfermedad granulomatosa crónica, en este BOLETIN.

INVESTIGADOR o INSTITUCION QUE APORTA el METODO

Dra. Diana Garcia de Olarte
Programa de Vigilancia Epidemiológica para el Síndrome de Infección Recurrente Patológica e Inmunodeficiencias Primarias
Laboratorio de Inmunología (206)
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia
Carrera 52D N° 62-28.
Medellin - Colombia

Telefonos: (57 4) 510 60 60, 510 60 61

Fax: 263 35 09 o 2638282.

Consultas a:
Dra Diana Garcia de Olarte

MUESTRA

Esta prueba requiere una muestra de sangre fresca sin anticoagulante

REACTIVOS

PBS +++

200midePBS pH7,3
180 m l de CaCI2 1 M
100 m l de MgCI2 1 mM
D-Glucosa 270 mg 7,5 mM

PMA ( Sigma P - 8139)

Hacer una solución madre en DMSO a 2 mg/ml, el dia de la prueba, (utilizar guantes y manejar con cuidado, producto carcinogenico) esta solucion se guarda en alicuotas (10 m l) a -20°C.

Solución de NBT (Nitroazul de tetrazolium Sigma N-6876)

Debe preparase fresca el dia del ensayo.

Adicionar NBT al PBS+++ a una concentración de 1 mg/ml (se necesitan 2 ml por muestra). Se divide esta solución de NBT por mitades, marcando una como ( - ) y otra como ( + ) A la alicuota ( - ) se adiciona 1 m l/ml de DMSO. A la alicuota ( + )se adiciona 1 m l/ml de la solución PMA/DMSO.

Se colocan ambas soluciones al bano maria 37°C.

PROCEDIMIENTO

1. Tomar varias láminas de vidrio (portaobjetos) y limpiarlas con alcohol antiséptico (se necesitan 2 láminas por muestra, una marcada ( - ) o no estimulada y otra como ( + ) o estimulada). Se colocan las láminas en una incubadora a 37°C y se dejan calentar por 30 minutos.

2. Tomar muestras de sangre venosa periférica (en una jeringa de 1 ml) de pacientes y controles. Inmediatamente colocar gotas de sangre en un sitio de cada lámina, asi:

control(es): positivo - negativo
paciente(s): positivo - negativo

3. Incubar las láminas a 37°C /30 minutos en una cámara húmeda ( esta es una caja de Petri a la cual se le adiciona una gasa húmeda para lograr este efecto).

4. Con cuidado se retira el coágulo con PBS precalentado a 37°C y se lava con este mismo buffer la sangre no adherida. Se colocan de nuevo las láminas en las cajas de petri (que estaran en la incubadora), una para no estimulada y otra para estimulada.

HAY QUE TENER MUCHO CUIDADO DE NO CONTAMINAR CON PMA LA CAJA DE PETRI NO ESTIMULADA.

5. Dentro de la incubadora se cubre completamente la lámina ( - ) con 2 ml de la solucion de NBT.

De igual forma para la lámina ( + ), 2 ml de la solución de NBT.

6. Incubar las láminas 12 minutos / 37°C dentro de la incubadora.

7. Lavar las láminas con PBS precalentado a 37°C y se dejan secar al aire.

8. Fijar con metanol absoluto, por lo menos 1 minuto y deje secar al aire

9. Tenir las láminas con safranina al 1% durante 1 minuto (usar safranina comercial disponible), lavar luego con agua MQ y dejar secar al aire.

10. Adicionar medio de montaje y cubrir con cubreobjetos.

EXAMEN al MICROSCOPIO

Examinar las preparaciones bajo aceite de inmersión. Contar 200 neutrófilos en cada lámina, determinando el número de células ( + ) y ( - ) con o sin depósitos de formazan (placas estimuladas con PMA y placas libres de estimulo).

VALORES NORMALES e INTERPRETACION de RESULTADOS

Mas del 95% de los neutrófilos normales deben reducir el NBT. Es importante incluir el control no estimulado para este ensayo. Un resultado positivo del NBT en las láminas no estimuladas puede ser alto con sangre heparinizada, en comparación con cualquier otro anticoagulante o sangre fresca, debido a que la heparina puede formar un precipitado con el NBT. El vidrio tambien puede activar los neutrófilos.

CONTROL de CALIDAD

La lámina control no estimulada puede servir como un indicador para observar si se presenta o no contaminación con PMA durante el procedimiento. Si el numero de células positivas es muy alto en la lámina no estimulada, el ensayo debe repetirse.

REFERENCIA

Ochs HD, Igo RP, The NBT slide test. A simple screening method for detecting Chronic Granulomatous Disease and female carriers. J Pedriatr 83: 77-82, 1973.