METODO

MEDICION de ANION SUPEROXIDO en NEUTROFILOS de SANGRE PERIFERICA
Ultima revisión: 30 abril 1997

APLICACION

A. Clasificación fenotípica

5.4 Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)

Para detalles, ver: Confirmación del diagnóstico e identificación del defecto molecular de la enfermedad granulomatosa crónica, en este BOLETIN.

INVESTIGADOR o INSTITUCION QUE APORTA el METODO

Dra. Diana Garcia de Olarte
Programa de Vigilancia Epidemiológica para el Síndrome de Infección Recurrente Patológica e Inmunodeficiencias Primarias
Laboratorio de Inmunología (206)
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia,
Carrera 52D N° 62-28.
Medellin - Colombia

Telefonos: (57 4) 510 60 60, 510 60 61

Fax: 263 35 09 o 2638282.

Consultas a:
Dra Diana Garcia de Olarte

MUESTRA

Ver: Aislamiento de PMN de sangre periférica, en este BOLETIN
Aislar los neutrófilos y llevarlos a 1x107/ml en PBS.

EQUIPO

Espectrofotómetro Biochrom 4060 UV / vis - Pharmacia o similares

REACTIVOS

Citocromo C (Sigma C - 7752): 18,5 mg/ml en agua destilada desionizada

PMA ( Sigma P - 8139): Hacer una solución madre en DMSO a 2 mg/ml

El dia de la prueba, diluir 1:25 en DMSO.

SOD (Sigma S - 2515):Hacer una solución madre a 3 mg/ml en agua destilada.

PROCEDIMIENTO: (Reacción en 1 ml)

1. Depositar en una cubeta para espectrofotómetro Sigma C - 5416):

827 ml PBS+++
50 mll Citocromo C (75 m M concentración final)
20 ml de agua MQ (Agua grado reactivo 1) o
SOD ( 60 m g/ml concentración final).

Calentar/37°C/7 min.

Agregar 100 ml de celulas en suspensión y calentar/3minutos

Calentar el espectrofotómetro 30 min antes de usarlo

El baño de circulación de agua debe estar a 39.5 °C para mantener la temperatura a 37 °C en la cubeta.

2. Esperar que el espectrofotómetro lea las muestras durante 180 segundos, hacer una pausa y adicionar 2,5 m l de PMA (200 ng/ml concentración final) mezclar por inversión usando parafilm y leer durante 599 segundos.

3. El resultado del citocromo C reducido se expresa en nmol de °2- / min / 107 celulas. Para realizar el cálculo, se determina la rata máxima de cambio (DO/seg), que equivale a la pendiente y se divide por el coeficiente de extinción (1 mM de citocromo C reducido = 18.5 DO).

Ejemplo del cálculo:

Pendiente: 0.0037523 DO / seg
= 0.225 DO / min
= 0.225 (DO / min) / 18.5 (coeficiente de extinción)
= 0.01216
= 12.16 nmol / mol / (106 PMN) / min
= 121.6 nmol O2-/ min / 107 celulas.

VALORES NORMALES

Se determinan en base al control normal de cada experimento.

REFERENCIAS

Curnutte JT, Kuver R. Babior MB. Activation of the respiratory burst oxidase in a fully solubles system from human neutrophils. J Biol Chem 262: 6450 - 6452, 1987.

Curnutte JT, Badwey JA, Robinson JM, Karnovsky MJ, Karnovsky ML. Studies on the mechanism of superoxide release from human neutrophils stimulated with arachidonate. J Biol Chem 259: 11851 - 11857, 1984.