OFERTA de ANALISIS de MUESTRAS

CONFIRMACION del DIAGNOSTICO e IDENTIFICACION del DEFECTO MOLECULAR de la ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRONICA
Ultima revisión: 30 abril 1997

APLICACION

A. Clasificación fenotípica

5.4 Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)

B. Defecto molecular (ver clasificaciones propuestas)

5.1 Deficiencia de gp91 phox

5.2 Deficiencia de p22 phox

5.3 Deficiencia de p47 phox

5.4 Deficiencia de p67 phox

C. Herencia

Ligada al sexo y autosómica recesiva

LABORATORIO QUE OFRECE REALIZAR el TEST

Programa de Vigilancia Epidemiológica para el Síndrome de Infección Recurrente
Patológica e Inmunodeficiencias Primarias
Laboratorio de Inmunología (206)
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia,
Carrera 52D N° 62-28.
Medellin - Colombia
Telefonos: (57 4) 510 60 57, 510 60 60, 510 60 61
Fax: 263 35 09

Contactos
Personas que deben contactarse antes de enviar una muestra:
Diana García de Olarte. Correo electrónico: dgarcia@catios.udea.edu.co
Pablo J. Patiño. Correo electrónico: ppatmo@catios.udea.edu.co

DESCRIPCION de la EVALUACION OFRECIDA

La evaluación ofrecida aqui debe realizarse en pacientes ya diagnosticados con EGC. Los métodos necesarios para el diagnóstico, publicados en el apéndice de este BOLETIN, que debieran montarse en laboratorios de inmunología locales, son los siguientes:

Estos exámenes son faciles de realizar. Los métodos necesarios estan publicados en el apéndice de este BOLETIN.

Antes de describir los exámenes ofrecidos en nuestro laboratorio, conviene dar algunas características de las distintas formas moleculares de la ECG:

Referencia: Curnutte JT. Chronic Granulomatous Disease: the solving of a clinical riddle at the molecular level. Clin Immunol Immunopathol 67 :S2-S15, 1993

Nosotros ofrecemos hacer los siguientes exámenes:

1. Medición del H2O2 por citometría de flujo con dihidrorodamina

2. Medición del citocromo b558

3. Western blot para las proteinas de la NADPH oxidasa: gp91 phox, p22phox, p47phox, p67phox en muestra de sangre venosa periférica con ACD. En esta muestra tambien haremos los

4. Estudios de genética molecular: polimorfismos conformacionales de cadena simple (SSCP) y secuenciamiento del DNA para buscar las alteraciones a nivel de los genes de las proteinas de la NADPH oxidasa.

Estos exámenes completan el diagnóstico de EGC. La secuencia de los procedimienots diagnósticos realizados localmente y en nuestro laboratrio es la siguiente:

1. Con el NBT o la citometría de flujo con dihidrorodamina (DHR) para detectar la producción de H202 se hace un diagnóstico de EGC

2. Para confirmarlo se realiza el estudio de la producción de anion superoxido.

3. Para definir que tipo de defecto tiene el paciente, se llevan a efecto dos estudios:

a. La búsqueda del citocromo b558 para definir si es un defecto en la producción de la glicoproteina gp91-phox de la NADPH oxidasa de los neutrofilos.

b. El estudio de Western blot para determinar la presencia de las diferentes proteinas de la NADPH oxidasa de los neutrofilos:
gp91phox, p22phox, p47phox y p67phox

Los resultados se interpretan de la siguiente manera:

1. Si el NBT es negativo o bajo, si hay ausencia o disminución en la producción de anión superóxido, no hay citocromo b558 y no hay expresión de la proteina gp91phox en el Western blot, se hace diagnóstico de Sindrome de EGC por defecto de la gp91phox. Esta es recesiva ligada al cromosoma X.

Para saber el tipo de defecto(s) que hay a nivel del respectivo gen, se procede a hacer análisis genético molecular por medio del estudio de los polimorfismos conformacionales de cadena simple (SSCP) y de secuenciamiento del DNA. Se estudiarán la madre y las familiares de sexo femenino de la rama materna para buscar portadoras. Asi mismo se investigara al padre y a los hermanos.

2. Si el NBT y la producción de anión superóxido tiene valores intermedios, se procederá a buscar la presencia de las proteinas de la NADPH oxidasa de los neutrófilos (ya mencionadas); en estos casos puede tratarse de una enfermedad autosómica recesiva por defectos de la p47phox o p67phox. Se deben estudiar el padre, la madre y los hermanos. Se realizará secuenciamiento del DNA de los respectivos genes de las proteinas para definir las alteraciones a este nivel.

REQUISITOS del PACIENTE

Información mínima a llenar en formulario LAGID:

Información demográfica

Arbol genealógico

Infecciones. Antecedentes de vacuna y escara BCG

Recuento de glóbulos blancos

Niveles de IgM, IgG e IgA

Calificaciones mínimas del paciente

Diagnóstico presuntivo de EGC: NBT negativo y no producción de O2-

Infecciones sugerentes de EGC

CARACTERISTICAS de la MUESTRA de SANGRE

Las cantidades de sangre total que hay que obtener para realizar las pruebas ofrecidas son las siguientes:

Medición del anion superóxido: 15 ml, míninmo 10ml.

Determinación del citocromo b588: 15 ml

mas citometría de flujo DHR para H2O2: 20 ml mínimo

Estudios de DNA, RNA, SSCP y secuenciamiento de DNA: 15 ml

Muestra de sangre venosa en ACD

ACD: Acido cítrico H20 (monohidratado), 29,42 g (0,14M)

Citrato de sodio (sal trisodica), 2 H20 58,82 g (0,20M)

Dextrosa (D+Glucosa), 39,64 g (0,22M)

Cantidad hasta 1.000 ml agua MQ, almacenar a 4°C

Preparacion de la muestra a enviar:

1. Retirar la aguja o pericraneal de la jeringa y verter la sangre por la pared del tubo evitando la formación de coágulos y burbujas; este paso debe hacerse rápido para evitar que la hipertonicidad del ACD destruya celulas. La relacion sangre / AC D es 5: 1; por cada 5 ml de sangre se agrega 1 ml de ACD. El volúmen mínimo de sangre venosa periférica, tanto para el paciente como para el control, es de 15 ml. Por ninguna razón debe alterarse esta relación (15 ml de sangre y 3 ml de ACD). Tapar y mezclar la sangre y el ACD por inversión suave pero rápida del tubo.

Nota: El tubo debe contener el anticoagulante antes de agregar la sangre, no invertir este orden.

2. Dejar el tubo en posición vertical, golpear suavemente la tapa y retirarla, limpiar el borde del tubo con servilleta esteril y sellar con tapa nueva y parafilm.

3. La identificación de la muestra debe tener: Nombre y apellidos del paciente, fecha, hora, lugar de la toma y remitente (se envia con rótulo).

4. El anterior procedimiento se repite para la toma de muestra del control, que debe ser un individuo normal, sin antecedentes de consumo de antiinflamatorios ni esteroides en los últimos 10 dias.

5. Las muestras deben ser enviadas en hielo (sin congelar!), por correo certificado con entrega en 24 horas.

LOGISTICA del ENVIO de MUESTRA

Por ningún motivo enviar muestra sin acuerdo previo.

Enviar fax con numero de envio al momento de despachar la muestra.

Conviene consultar antes con la empresa de correo especial que se desee usar. Para DHL, debe complearse un formulario de acuerdo en la oficina local antes de iniciar el envío de la muestra!

Para todo envío, deben cumplirse los requisitos de las empresas de envío rápido. Debe especificarse que la muestra de sangre no es infecciosa, y debe completarse toda la información solicitada.

RESULTADOS

Se enviarán dentro de dos semanas por correo electrónico o fax.

COMENTARIO

De acuerdo al estudio respectivo se hará un diagnóstico presuntivo o definitivo.