METODO

DETERMINACION del CITOCROMO b558 en NEUTROFILOS APLICACION
Ultima revisión: 30 abril 1997

A. Clasificación fenotípica

5.4 Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)

Para detalles, ver: Confirmación del diagnóstico e identificación del defecto molecular de la enfermedad granulomatosa crónica, en este BOLETIN.

INVESTIGADOR o INSTITUCION QUE APORTA el METODO

Dra. Diana Garcia de Olarte
Programa de Vigilancia Epidemiológica para el Síndrome de Infección Recurrente
Patológica e Inmunodeficiencias Primarias
Laboratorio de Inmunología (206)
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia,
Carrera 52D N° 62-28.
Medellin - Colombia

Telefonos: (57 4) 510 60 60, 510 60 61

Fax: 263 35 09 o 2638282.

Consultas a:
Dra Diana Garcia de Olarte

MUESTRA

Ver: Aislamiento de PMN de sangre periférica, en este BOLETIN.
Aislar los neutrófilos y llevarlos a 1x107/ml en PBS.

EQUIPO

Espectrofotómetro Biochrom 4060 UV / vis o similares.

Registro: 600 a 400 nm
Intervalo: 0,5 nm
Absorvancia: 0,1 a-0,1 D.O.
Ventana: 1 nm
Réplica: 2 seg, 100 nm/min

REACTIVOS

1. 0,1 M KH2PO4 ajustarpH 7,25 (KOH 8 N)

2. Triton X- 100 no diluído

3. Buffer Tritón 2% (v/v) en el anterior buffer.
Buffer 0,1 M KH2PO4 49 ml
Triton X- 100 1 ml

4. Ditionita de sodio seca (Na hidrosulfito)

5. PBS+++
200 ml de PBS pH 7,3
180 ml de CaCI2 1 M
100 ml de M;gCI2 1 mM
270 mg de D - glucosa

PROCEDIMIENTO

1. Llevar suspensión celular a una concentración de 1X107 PMN / ml

2. Tomar 1 ml y adicionar PBS+++ hasta 12 ml

3. Centrifugar 200 x g /4°C/10 min

4. Descartar el sobrenadante.

5. Resuspender 1x107 PMN en 400 m l de TX100 al 2%

6. Incubar en hielo por 10 min.

7. Centrifugar 27.000 x g / 4°C /20 min.

8. Cubeta de referencia: Transferir 350 ml TX100 2% + 400, ml de buffer 0,1 M KH2PO4

9. Registro del espectro oxidado: 350 ml de muestra + 400 ml de buffer 0,1 M KH2PO4

10. Adicionar unos pocos granos de ditionita, mezclar y registrar el espectro reducido.

11. Substraer el espectro oxidado para obtener el espectro reducido neto X mostrando los picos de absorbancia específicos del citocromo b 558: g a 428 nm, b a 530 nm y a a 558nm.

REFERENCIAS

Cross AR, Hingson FK, Jones OTG, Harper M, Segal AW. The enzymic reduction and kinetics of oxidation of cytochrome b245 of netrophils. Biochem J 204: 479 485, 1982.

Weening RS, Corbeel L, De Boer M, Lutter R. Zwieten RV, Hamers MN, Ross D. Cytochrome b deficiency in autosomal form of chronic granulomatous disease. J Clin Invest 75: 915 - 920, 1985.